Lični broj – DNK:
Bar-kod života

Vrlo dobro su vam poznate nalepnice na proizvodima predstavljene nizom crnih i belih linija koje je moguće posebnim uređajima lako optički prepoznati. Koriste se za identifikaciju i brzo prepoznavanje proizvoda. Obrazac crnih linija na beloj pozadini, sa različitim kombinacijama debljine, rasporeda i brojeva, pruža mogućnost da veliki broj proizvoda bude identifikovan. Na sličan način, kratki segment DNK sekvence u mitohondrijama eukariotskih ćelija, sastavljene od A, C, G i T nukleotida, pruža mogućnost razlikovanja i identifikovanja različitih vrsta organizama.

Dakle, DNK bar-kodiranje je taksonomski metod koji koristi kratki genetički marker u DNK molekulu organizma zarad identifikovanja njegove pripadnosti određenoj vrsti. Kada razmislite, DNK bar-kodiranje otvara nezamisliva polja istraživanja i mogućnosti:

– jednostavnu i brzu identifikaciju vrste uz pomoć malog segmenta DNK;

– na svim stupnjevima života od semena ili embriona do zrele jedinke;

– otkriva nove vrste među onima koje morfološki liče ili su identične;

– i najvažnije, mogućnost pronalaska i opisivanja biodiverziteta naše planete koji nestaje, ali sa druge strane i nastaje, pred našim očima, a mi nismo u mogućnosti da ga uočimo.

Do sada.

Eukariotske ćelije u svojoj citoplazmi sadrže jedro, strukturu u kojoj se nalazi genetički materijal svake ćelije (genom) okružen omotačem (plazma membranom). Mitohondrije su organele koje se takođe nalaze u ćeliji, imaju svoj omotač i predstavljaju bakterije koje su ušle u simbiozu sa eukariotskim ćelijama pre oko dve milijarde godina. One su "energetske fabrike" ćelije, jer za nju sintetišu ATP, izvor hemijske energije uz pomoć kog se odigravaju biohemijske reakcije u ćeliji. Broj mitohondrija zavisi od vrste ćelije, od desetak do hiljadu u ćelijama mišića. S obzirom da su te organele bile bakterije, i same imaju svoj genom. U jedru svake ćelije kičmenjaka genom sadrži oko 20.000 protein kodirajućih gena, dok mitohondrijski genom sadrži samo 37 gena. Čak 13 njih daje subjedinice respiratornog kompleksa koji prenosi elektrone do kiseonika i omogućava ćelijsko disanje. Ostalih 39 subjedinica prepisuje se sa nuklearnih gena. Dakle, ogroman proteinski kompleks koji obavlja ćelijsko disanje sastoji se od proteina kodiranih kako sa gena iz jedarnog tako i sa mitohondrijskog genoma. Mitohondrijska DNK (mtDNK) ima višu stopu mutacija nego jedarna DNK. Ovo rezultira u značajnoj različitosti u sekvencama mtDNK između vrsta, no malu varijabilnost mtDNK između jedinki iste vrste. Takođe, mitohondrije se nasleđuju samo preko majke (prenose se samo putem citoplazme, a jajna ćelija je donor citoplazme prilikom oplođenja, tako da u jednom organizmu sve mitohondrije potiču samo od majke).

DNK bar-kodiranje se zasniva na relativno jednostavnom principu. Za bar-kod vrste naučnici su odabrali sekvencu mitohondrijske DNK dužine samo 648 nukleotida koja im je do sada pomogla da uspešno identifikuju i razlikuju skoro 65.000 vrsta organizama. Ta 648 nukleotida dugačka sekvenca jeste gen koji kodira za subjedinicu I enzima citohrom oksidaze (COI) koji upravo čini jednu od subjedinica ogromnog proteinskog kompleksa koji ima ulogu u ćelijskom disanju. Kao što smo napomenuli, 13 subjedinica sintetiše mitohondrija, ostalih 39 sintetiše jedro, i ova dva genoma moraju da funkcionišu zajedno, inače će enzim biti nefunkcionalan, respiracija se neće obavljati i ćelija umire. Zato se pokazalo da iako mitohondrijalni genom podleže promenama nukleotida 10-30 puta brže od jedarne DNK, količina promena u obe DNK je ista. Posledica je da dva genoma evoluiraju zajedno, stalno se adaptiraju jedan na drugog. Ako adaptacija izostane, enzim je nefunkcionalan i smrt je zagarantovana. I upravo je na osnovu mnogih istraživanja pokazano da je broj promena u mitohondrijskoj DNK proporcionalan broju promena u genomskoj DNK, i na osnovu razlika u redosledu nukleotida COI gena između dva organizma možete odrediti da li se radi o dve iste ili različite vrste. Recimo, kod ljudi, sekvenca se ne razlikuje u više od 2 nukleotida, dok je razlika između ljudi i šimpanzi 60, a gorila 70 nukleotida. Ako između dva insekta imate razliku sekvenci COI gena od 2,5 odsto, možete biti sigurni da su to dve različite vrste i da su se njihove predačke linije razdvojile pre više od milion godina.

Primena DNK bar-kodiranja je raznovrsna i neiscrpna. Herbert i saradnici sa Odeljenja za zoologiju Univerziteta u Gelfu, u Kanadi, u radu iz 2004. godine ulažu napor da otkriju odnos između vrsta klasičnim taksonomskim principima i njihovu proveru DNK bar-kodiranjem kod ptica Severne Amerike. Sekvenciranjem (iščitavanjem redosleda nukleotida DNK molekula) COI gena 260 od 667 vrsta ptica, pokazano je da je svaka od 260 vrsta imala drugačiju sekvencu. U okviru iste vrste, variranja u sekvencama iznosila su 0,43 odsto, dok je između vrsta ta varijabilnost sekvenci iznosila 7,93 odsto. Nađene su i četiri populacije sa razlikama u sekvencama koje upućuju na nove vrste. Tri od te četiri su kasnije i taksonomski potvrđene kao nove vrste. Isti tim radi na zanimljivom projektu na leptirima severozapadnog dela Kostarike, Astraptes fulgerator, opisanih još 1775. godine. Ovaj leptir je dugo smatran jedinstvenom vrstom, uobičajenom i rasprostranjenom od juga SAD do juga Argentine, od pustinja do prašuma. Sekvenciranjem 484 jedinke pokazano je da je vrsta Astraptes fulgerator zapravo kompleks od najmanje 10 kriptičnih vrsta. Kasnije studije su pokazale da se ipak radi o kompleksu od 3 do 7 novih vrsta, ali sama činjenica da je ovaj leptir, koji je 2 veka smatran jednom vrstom, zapravo kompleks kriptičnih vrsta, otkriva potpuno nove vidike kompleksnosti biološkog diverziteta, diverziteta koji treba otkriti.

Pokazano je da je metod DNK bar-kodiranja moguć i kod biljaka, s tom razlikom da se kod njih vrši sekvencioniranje DNK iz plastida (organele biljaka i algi u kojima se odvija fotosineza, sintetišu i čuvaju mnoga hemijska jedinjenja od značaja za ćeliju, nastala takođe simbiozom bakterija sa biljnim ćelijama, i imaju sopstveni genom neznatno drugačije strukture od mitohondrijskog). Sekvence izbora za razlikovanje biljnih vrsta su rbcL i matK hloroplastni geni. Interesantna primena ovakve metode jeste u radu Odeljenja za biologiju Univerziteta u Tromsu u Norveškoj gde su proučavali mreže ishrane između sitnih glodara i biljaka tajgi. U tajgama, četinarskim šumama severnih predela umerene klime, sitni glodari su vrlo važna karika u lancu ishrane između vegetacije i predatora. DNK bar-kodiranjem biljnog sadržaja iz njihovog stomaka tačno se moglo saznati kojim biljnim vrstama se oni hrane.

Naravno, veliki broj naučnika, posebno onih koji se bave klasičnom sistematikom i taksonomijom, kritikuje DNK kodiranje kao metod identifikacije novih vrsta. Na primer, zamerke su da ne daje dovoljno informacija o kategorijama iznad vrste, ili da dve vrste koje su se relativno skoro razdvojile ne mogu biti uočene na nivou razlikovanja DNK bar-koda. Ubedljiva zamerka, koju smo i mi uočili u našoj laboratoriji, jeste da nova COI sekvenca ne bude ništa drugo do prepisan pseudogen ili COI gen nekog simbionta ili parazita tog organizma, ili čak plena koji je npr. insekt pojeo tog dana, što može pogrešno da navede na zaključak o otkriću nove vrste. U ovom trenutku najbolje je koristiti DNK bar-kodiranje zajedno sa klasičnom taksonomijom, ekologijom i dopunskim, alternativnim molekularno-biološkim analizama, kako bi se problematika nekog slučaja što bolje rešila, a greške otkrile i otklonile. Konačno, kako je veći deo biodiverziteta naše planete još uvek nepoznat, DNK bar-kodiranje treba koristiti kao primarnu, jednostavnu i dopunsku metodu kojom možemo naslutiti postojanje, ali ne i opisati novu vrstu. I ko zna, možda u skorijoj budućnosti svima bude dostupan mali prenosivi čitač DNK bar-kodova živog sveta, sa kojim ćemo moći da izađemo u prirodu i otkrijemo nezamislivu raznovrsnost i lepotu sveta koji nas okružuje.

Mirko Đorđević